Kontynuacja przebojowej komedii fantastycznej o muzeum, w którym nocą ożywają zgromadzone w nim niezwykłe eksponaty. Tym razem akcja toczy się w największym muzeum na świecie, słynnym Smithsonian, w którym podziwiać można 136 milionów eksponatów, a wśród nich: samolot, w którym Amelia Earhart przeleciała Atlantyk, pamiątki po Alu Capone i patofelki Dorotki z filmowego "Czarnoksiężnika z krainy Oz". Gdy zapada noc, przewodnicy kończą pracę i idą do domu, a szkolne wycieczki kończą zwiedzanie, w waszyngtońskim Instytucie Smithsonian dzieje się coś niezwykłego. Nocny strażnik Larry Daley (w tej roli Ben Stiller) przeżyje największą przygodę swego życia. W drugiej części „Nocy w muzeum" Larry stoczy epicką walkę, która mogła się odbyć tylko w największym kompleksie muzealnym na świecie. Daley będzie musiał stanąć w obronie przyjaciół-eksponatów.